PCO FLIM技術(shù)助力化學和微流控研究（1）：pco.flim相機成功用于DAOTA pH值感測
Background-free fluorescence decay time sensing and imaging of pH with highly photostable diazaoxotriangulenium dyes
高耐光性重氮雜氮染料pH值的無背景熒光衰減時間感測和成像
Irene Dalfen, Ruslan I. Dmitriev, Gerhard Holst, Ingo Klimant, Sergey M. Borisov
Anal. Chem. 2019, 91, 1, 808–816
Publication Date:December 6, 2018
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b02534
摘要翻譯
文章報道了一種用于基于壽命的自參考pH值感測的新型熒光二氮雜三棱（DAOTA）pH指示劑。DAOTA染料用酚類受體基團修飾，通過光誘導電子轉(zhuǎn)移機制誘導熒光猝滅。吸電子氯取代基確保在最相關(guān)的pH值范圍內(nèi)響應（p，p-二氯苯酚和p-氯酚取代染料的表觀pK'a值分別為~ 5和7.5）。這些染料具有較長的熒光壽命（17-20 ns）、高量子產(chǎn)率（~ 60 %）和高光穩(wěn)定性。將染料固定在聚氨酯水凝膠D4中制備平面光電極。除了對熒光強度的響應外，光電極還表現(xiàn)出依賴于pH的壽命行為，這使得它們適合借助熒光壽命成像技術(shù)研究2D pH分布。對于具有高染料濃度（相對于聚合物為0.5-1 % wt.）的傳感器而言，壽命響應尤其顯著，并歸因于有效的均勻熒光共振能量轉(zhuǎn)移機制。
關(guān)鍵詞：衰減時間，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，pH傳感器，三角藻，光誘導電子轉(zhuǎn)移，頻域FLIM
圖文節(jié)選（1）
圖5:D4（1 % wt）中基于PhOHCl2-DAOTA的平面光電極pH的FLIM成像。（a） ：顯微成像實驗中獲得的熒光壽命的pH依賴性（讀出區(qū)～ 0.9 x 0.9毫米）。金屬箔已在室溫下測量≥ 每個pH值有3個不同的點。（b） ：帶有集成傳感器箔的微流控芯片的照片圖像。（c） 和（d）：使用pH 6.5和5.0的緩沖液（速度21 μL min-1）同時沖洗的微流控芯片的衰變時間和pH分布的偽彩圖像
圖文節(jié)選（2）
使用PCO（www.pco.de）的pco.flim相機在頻域內(nèi)進行成像實驗。激發(fā)源Omicron（www.Omicron-laser.de）的488 nm激光二極管（PhoxXplus 488-200用于pco.flim），以15 MHz調(diào)制頻率（方波調(diào)制）進行調(diào)制。平均激光功率為100 mw。Nikon的NIS Elements AR顯微鏡軟件用于數(shù)據(jù)采集和處理。對于顯微鏡測量，從傳感器箔上切下直徑為5 mm的傳感面積，并將其粘在Greiner bio one（www.gbo.com）的一個黑色96微孔板上。使用配備尼康Plan Apo 20x/0.75物鏡和安裝在相機上的0.7x相機適配器的尼康Eclipse Ti-S顯微鏡獲取圖像。濾塊兒包括一個激發(fā)帶通濾波器FF02-482/18、一個二向色鏡Di02-R488和一個發(fā)射長通濾波器BLP01-488R，均來自Semrock（www.Semrock.com）。使用Starna Scientific（www.Starna.com）的染料摻雜樣片UMM/SFG作為壽命標準（τ=3.75 ns）……為了證明傳感器的實際適用性，我們使用一種新的頻域壽命成像相機pco.flim對其進行了實驗調(diào)查。在成像實驗（圖5a）和TCSPC（圖4）中獲得的熒光衰減時間的pH依賴性相似。放置在微流控芯片（圖5b）腔室中的平面光電極被證明非常適合監(jiān)測pH梯度（圖5c和5d）。這可能有用，例如，用于監(jiān)測酶反應和等電聚焦。該實驗還表明，平面光電極與FD-FLIM相機結(jié)合也可用于宏觀上的其他實驗，例如監(jiān)測生物膜或傷口愈合期間的pH值。
關(guān)于pco.flim
pco.flim相機系統(tǒng)是第一種采用Two-Tap CMOS成像芯片的熒光壽命成像相機。相機的像素和激發(fā)光間的同步使100皮秒至100微秒間的熒光衰減時間的分析成為可能。在1008 x 1008像素分辨率上，pco.flim最多可以讀取45個雙幀/秒，且可支持5 kHz – 40 MHz頻率范圍的調(diào)制。
基本參數(shù)：
pco.flim激光器作為落射熒光測量的光源
可選擇的激光波長和輸出功率
100 ps到100 μs的壽命測量
調(diào)制頻率從5千赫茲到40兆赫
500千赫茲到40兆赫外部調(diào)制信號
正弦/矩形的調(diào)制信號波形
像素分辨率1008 x 1008
頻域FLIM
USB 3.0接口
量子效率39 %
動態(tài)范圍1000:1
45 雙幀/秒 (2 tap讀出)
可選曝光時間為1 ms到2 s
無振動水冷
特殊的測量與分析軟件
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【關(guān)于PCO】
PCO的字義正是基于我們的角色：Pioneer in Cameras and Optoelectronics – 相機和光電技術(shù)的先鋒。
經(jīng)過30年專業(yè)知識和經(jīng)驗的積累，PCO已被打造成科研和工業(yè)應用領域中數(shù)碼相機的前沿專家和創(chuàng)新者，其產(chǎn)品廣泛應用于生命科學、物理科學、高速成像和機器視覺。
我們擁有市場上最豐富的sCMOS相機序列，具有全球認可的開發(fā)各種技術(shù)領先、性能優(yōu)良、型號廣泛的相機系統(tǒng)的實力。我們在世界各地的機構(gòu)和伙伴保證PCO相機的研制和支持能夠滿足用戶的應用。我們的產(chǎn)品研制和支持團隊可以直接采納用戶意見。我們在產(chǎn)品硬件和軟件上的不斷前進，支撐了我們強大的創(chuàng)新力量和競爭實力。
【關(guān)于Excelitas Technologies Corp.】
Excelitas Technologies Corp.是科技領域的領導者，提供高性能、市場驅(qū)動的光子創(chuàng)新產(chǎn)品，滿足全球客戶對照明、光電、探測和光學技術(shù)的需求。Excelitas Technologies Corp.服務于汽車、消費品、國防和航空航天、工業(yè)、醫(yī)療、安全和安防以及科研領域的眾多應用，致力于促進客戶取得成功。我們的團隊由 7,000 名專業(yè)人員組成，他們在北美、歐洲和亞洲工作，為全球客戶提供服務。